細(xì)胞培養(yǎng)三種重要試劑總結(jié)大全?。?！

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           培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基貯存于4 oC 冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37 oC 水槽中溫?zé)帷?nbsp;

液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個(gè)月，期間glutamine 可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，  可以再添加適量glutamine。

粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)： 

    3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為  7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成  pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生  長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。 

   3.2. 材料： 

   3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)  3.2.2. 粉末培養(yǎng)基  

   3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)  3.2.4. 電磁攪拌器  3.2.5. 無菌血清瓶  

   3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜  3.2.7. pH meter  3.2.8. 真空幫浦  3.2.9. CO2 氣體    

  3.3. 步驟：

  3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。 

   3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一)溶于200ml  milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。 

   3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌?nbsp; 溶液之pH 應(yīng)為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。 若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時(shí)，  pH 會(huì)升高0.1-0.2。 

  3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時(shí)分裝至無菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)  基種類、日期、瓶號(hào)等，貯存于4 oC。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)   

  3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。 

  4. 配制培養(yǎng)基之生長(zhǎng)測(cè)試  

  4.1. 材料： 

 4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)  4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)  4.1.3. methanol  4.1.4. glacial acetic acid  

4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 

  4.2. 步驟： 

  4.2.1. 以待測(cè)試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35  mm TC dish) 中，每個(gè)well 接種1 × 102 活細(xì)胞，同時(shí)作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長(zhǎng)，待細(xì)胞群  落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時(shí)即可。 

  4.2.3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜  置10 min。 

  4.2.4. 去除固定液，水洗二次。 

  4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。4.2.6. 去除染液，水洗二次。 

  4.2.7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號(hào)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不  佳，則丟棄之。

抗生素

1. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素  

1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。 

1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待  token freeze 通過污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。 

2. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask 時(shí)，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml +  streptomycin 100 ug/ml)。 

3. 若要檢測(cè)mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會(huì)抑制  mycoplasma 生長(zhǎng)。 

4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin  250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。 

5. 抗生素使用種類與濃度： 

工作濃度. 儲(chǔ)存溫度. 殺滅細(xì)菌  

penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria  

streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria  

chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria  

gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma  amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds  nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds  fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds 

血清

1. 血清必須貯存于–20 ～ -70 oC，若存放于4℃，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。如果一次無法用完一  瓶，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %，  必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。 

2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加  入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。 

3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室  溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖  晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20 oC 直接  至37 oC 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。 

4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分鐘加熱已*解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均  勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建  議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沈淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and  platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell  type。

5. 勿將血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較  不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。 

 6. 血清之沈淀物  

6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性  及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會(huì)影響血清本  身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上  清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀?huì)  阻塞過濾膜。 

6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)"：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物的形成會(huì)顯著的增多。 有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)"，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清  放在37 oC 中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37 oC 環(huán)境下，又會(huì)使此沈淀物增多，更  會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒有污染。一般而言，此  小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長(zhǎng)，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批  號(hào)的血清。

7. 血清之生長(zhǎng)測(cè)試  7.1. 材料： 

7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)  

7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )  7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)  7.1.4. methanol  7.1.5. glacial acetic acid  

7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)  7.2. 步驟： 

7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測(cè)試過) 培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞于T75 flask 至80  % confluency。 

7.2.2. 以trypsin-EDTA 處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細(xì)  胞懸浮液，并測(cè)細(xì)胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細(xì)胞濃度為1×102 活  細(xì)胞數(shù)/ ml。 

7.2.3. 將1 ml 細(xì)胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血 

清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為10  % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測(cè)試過之血清同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組試驗(yàn)。7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大  到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。 

7.2.5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜  置10 min。 

7.2.6. 去除固定液，水洗二次。

7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。7.2.8. 去除染液，水洗二次。7.2.9. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)  

7.2.10. 計(jì)算SPE ( Serum Plating Efficiency )：SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %  7.2.11. 計(jì)算RPE(Relative Plating Efficiency)： 

SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %  7.3. 比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測(cè)血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。7.4. 訂購(gòu)多量同一批號(hào)的優(yōu)良血清，置于–70 oC 保存之